Információ

Western blot alternatívák


Egy kísérleti fertőzésből származó in vivo mintát figyelembe véve szeretném megnézni, hogy jelen van -e bakteriális fehérje.

Gondolkoztam a Western Blot -on, amely baktériumokkal fertőzött állatok szérumát használja. Ennek a stratégiának azonban pozitív kontrollra van szüksége, amely előzetes génklónozást és expressziót igényel.

Talán van rövidebb út is.

Kösz


Úgy gondolom, hogy az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (vagy ELISA) a legjobb módszer erre, mivel van egy antitestje a fehérje ellen, amellyel bevonhatja a mintalyukakat… Egerek segítségével poliklonális antitesteket hozhat létre a fehérje ellen a fehérje befecskendezésével. és a szérum összegyűjtése és tisztítása ... mindaddig, amíg a tesztelt mintában nincs hasonló fehérje, mint a bakteriálisé ... de a fertőzés diagnosztizálásához használhat valami hasonlót, mint például a q-PCR, feltételezve, hogy a bakteriális DNS-t a mintát (tipikus bakteriális DNS -extrakciós technikákat használhat).

Ha többet szeretne megtudni az ELISA -ról, látogasson el ide. Itt egy jó animáció az ELISA -n: http://highered.mheducation.com/sites/0072556781/student_view0/chapter33/animation_quiz_1.html


Aptamer-alapú Western Blot a szelektív fehérjefelismeréshez

A szelektív fehérjefelismerés kritikus fontosságú olyan molekuláris biológiai technikákban, mint a Western blot és az ELISA. A célfehérjék sikeres kimutatása ezekben a módszerekben az antitestek specifikus kölcsönhatásán alapul, ami gyakran magas termelési költséget jelent és hosszú inkubációs időt igényel. Az Aptamers az egyszerű és megfizethető affinitás reagensek alternatív osztályát képviseli a fehérjék felismerésére, és az antitestek aptamerekkel történő helyettesítése Western blot módszerrel potenciálisan idő- és költséghatékonyabb lenne. Ebben a munkában több fluoreszkáló DNS -aptamert izoláltunk in vitro kiválasztása a gyakran használt címkefehérjék, köztük a GST, az MBP és a His-tag szelektív címkézésére. A generált G1, M1 és H1 aptamerek specifikusan kötődnek rokon célfehérjékhez, nanomoláris affinitással. A hagyományos antitest-alapú immunoblotozással összehasonlítva az ilyen aptamer-alapú eljárás tisztább hátteret adott, és képes volt szelektíven megjelölni a célfehérjét egy komplex keverékben. Végül az azonosított aptamerek hatékonyak voltak az azonos címkével rendelkező különböző fúziós fehérjék felismerésében is, ezáltal jelentősen kibővítve ezen aptamerek lehetséges alkalmazási körét. Ez a munka az aptamereket hasznos molekuláris eszközként szolgálta a szelektív fehérjefelismeréshez a Western blot elemzésben.

Kulcsszavak: Western blot aptamer funkcionális nukleinsav in vitro szelekciós fehérje felismerés.

Copyright © 2020 Wang, Li és Yu.

Ábrák

Az aptamer és antitest alapú összehasonlítás…

Az aptamer- és antitest-alapú fehérje blot elemzés összehasonlítása. A közös elektroforézis után transzfer és…

Az izolált aptamerek kifejezetten felismerik a célpontot…

Az izolált aptamerek specifikusan felismerik a célfehérjéket a Western blot -ban. Az aptamer másodlagos struktúrái…

Az Aptamer G1 szelektíven címkézi a GST…

Az Aptamer G1 szelektíven jelöli a GST fehérjét, és kedvezően hasonlít a nyugati antitestekhez…

A kiválasztott aptamerek képesek…

A kiválasztott aptamerek képesek fúziós fehérjéket jelölni Western blot módszerrel. (A) Aptamer…


Western blot normalizálás: gyorsabb, megbízhatóbb alternatíva a háztartási fehérjék használatához

Kenneth Oh a Bio-Rad Laboratories (CA, USA) fehérje-mennyiségi csoportjának együttműködési, alkalmazási és új technológiai termékmenedzsere. A biológiai szerves kémiából doktorált a Kaliforniai Egyetemen, Santa Barbara (CA, USA). A Bio-Rad-nál az Oh a fehérje mennyiségi meghatározásának új eszközeit vizsgálja, és oktatási tartalmat fejleszt az új termékekről és alkalmazásokról.

A Western blot egy népszerű módszer a fehérjeelemzésre, de a mennyiségi adatok elérése problémás lehet. A domináns Western blot módszer, amelyet háztartási fehérje (HKP) normalizálásnak neveznek, nehezen használható, és gondos vizsgálatot igényel a pontos eredmények eléréséhez. Azonban egy alternatív módszer, az úgynevezett teljes fehérje normalizálás (TPN) áll a kutatók rendelkezésére, amely gyorsabb és megbízhatóbb.

A Western -blot normalizálást használjuk a célfehérje szintjének különbségeinek meghatározására bizonyos kísérleti körülmények között, szövetekben, időpontokban vagy fejlődési szakaszokban. A tudósok ezt a módszert használják a minta -előkészítés, a minta betöltése vagy a gélátvitel során előforduló hibák okozta mintaváltozások ellenőrzésére, amelyek torzíthatják az eredményeket. Az adatok normalizálásának célja annak biztosítása, hogy az eredmények tükrözzék a minták közötti valódi különbségeket.

Több mint 30 éve a domináns módszer a HKP normalizálása. Sok kutató a HKP -kat, például aktint, tubulint és GAPDH -t használja belső kontrollként a normalizáláshoz, mivel ezek a fehérjék állítólag azonos szinten expresszálódnak, függetlenül a kísérleti körülményektől, és a kereskedelmi antitestek könnyen hozzáférhetők.

A HKP normalizálása azonban nem könnyű. Számos technikailag nehézkes lépés szükséges a HKP -k megfelelő teljesítményéhez. A HKP -kat kísérletileg kell validálni egy sor teszt segítségével, amely magában foglalja:

  • A pozitív kontroll tesztelje a HKP -t kifejező lizátumot
  • A negatív kontroll vizsgálatot olyan lizátum alkalmazásával, amelyben a HKP nincs kifejezve
  • An kifejezési szint teszt annak ellenőrzésére, hogy a HKP állandó a kísérleti körülmények között
  • A linearitási teszt a HKP lineárisan arányos jelét szolgáltató mintaterhelési mennyiségek meghatározásához.

A kutatóknak tisztában kell lenniük a HKP normalizálásának néhány hátrányával is:

  • A HKP -k nem mindig állandóak: számos szakértői értékelés azt mutatja, hogy a HKP-kat befolyásolhatják a kísérleti körülmények [1-7].
  • A HKP -k nagyon bőségesek a célfehérjékhez képest: gyakran nagy mintákra van szükség a kevésbé bőséges célfehérjék kimutatásához, ami a HKP sávok túltelítettségéhez és hibás számszerűsítéséhez vezet.
  • A HKP észlelés lépéseket tesz hozzá a standard Western blot protokollhoz: a kutatóknak le kell vetniük és újra kell vizsgálniuk a membránt HKP-specifikus antitestekkel, ami jelentősen növeli mind az időt, mind az eredmények változékonyságát.

A HKP -kkal ellentétben a TPN -en alapuló újabb normalizálási technikákat egyszerűbb végrehajtani, és növelhetik az eredményekbe vetett bizalmat.

A TPN -ben a mintában lévő összes fehérje adja a normalizálás alapját. A HKP -khoz képest a TPN nem igényel széles körű optimalizálást, és robusztusabb és pontosabb jelet biztosít.

A TPN a fehérjéket teljes fehérjefoltok vagy foltmentes technológiák segítségével detektálja. Egyes foltok, például a Coomassie Blue és az Amido Black, visszafordíthatatlanok, és két példányban kell futtatni őket, mert zavarhatják a későbbi antitestek festését. Más foltok, például a Sypro Ruby és a Ponceau S reverzibilisek, de általában nem egységes jeleket eredményeznek, és több festési és festési lépést tartalmaznak a fehérjék kimutatására.

A TPN kompatibilitása a foltmentes technológiákkal talán az egyik legnagyobb előnye. Mindössze 6 év alatt a foltmentes TPN csaknem 900 kutatási cikkben jelent meg [8], és számos okból az új szabványsá válik a Western blot adatok normalizálásához:


Töltse le az alkalmazási megjegyzést, vagy látogasson el a Nano-Glo & reg HiBiT Blotting System termékoldalára, ahol megismerheti a HiBiT címke érzékenységét és időtakarékos előnyeit a hagyományos blotolási módszerekhez képest, amelyek epitópcímke elleni antitestet használnak (pl. FLAG címke).

  1. Nakashoji, A. et al. (2020) A módosított HOXB9 mRNS azonosítása mellrákban. Onkológiai folyóirat. Cikk azonosítója 6065736,
  2. Schwinn, M.K. et al. (2020) Egyszerű és skálázható stratégia az endogén fehérje dinamika elemzésére. Sci. ismétlés. 10(1), 8953.
  3. Tange, N. et al. (2020) A staurosporin és a venetoklax indukálja a MEF2D-fúziós fehérjék kaszpázfüggő proteolízisét és az apoptózist a MEF2D-fúziós (+) ALL-sejtekben. Biomed Pharmacother. 128, 110330.
  4. Ranawakage D.C. et al. (2019) A HiBiT-qIP, a HiBiT-alapú kvantitatív immunprecipitáció megkönnyíti az antitest-affinitás meghatározását immunprecipitációs körülmények között. Sci. ismétlés. 9(1) 6895.
  5. Sasak, M. et al. (2018) Gyors és kvantitatív módszer kifejlesztése a vírus bejutásának és felszabadulásának elemzésére NanoLuc luciferáz komplementációs vizsgálat segítségével. Virus Res. 243, 69-74.
  6. Tamura, T. et al. (2019) A Reporter Flaviviridae vírusok in vivo dinamikája. J Virol. 93(22), e01191-19.

Legyen értesült a Promega eseményeiről, termékeiről és híreiről.

& másolás 2021 Promega Corporation. Minden jog fenntartva.


Mi az a Western Blot?

‘Western blot ’ az immunoblot másik neve, amely specifikus fehérjéket észlel a mintában. A ‘western blot ’ kifejezést azonban W alkotta meg. Neal Burnette 1981 -ben a DNS azonos nevű Southern blot után. Eközben a Southern blotot Edwin Southern brit biológus fejlesztette ki, hogy kimutassa a DNS -szekvenciákat egy membránfolton. Ezenkívül a ‘n Northern blot ’ az RNS kimutatására szolgáló technika, amelyet 1977 -ben James Alwine, David Kemp és George Stark fejlesztett ki a Stanford Egyetemen, Gerhard Heinrich közreműködésével.


Fehérjék elválasztása és membránátvitel mPAGE ™ előregyártott gélek segítségével

A poliakrilamid -gélelektroforézis (PAGE) egy mindenütt jelen lévő technika, amelyet a fehérjék elektroforetikus mobilitással történő elválasztására használnak. Míg a fehérjék natív (vagy hajtogatott) állapotukban elválaszthatók natív-PAGE-n keresztül, a fehérjéket jellemzően kémiailag denaturálják (vagy hajtogatják) nátrium-dodecil-szulfát (SDS) alkalmazásával redukálószerrel, például ditiotreitollal (DTT) az elválasztás előtt. Az SDS PAGE géleket a fehérjék molekulatömege alapján történő szétválasztására használják, összehasonlítva a mintákat ismert molekulatömegű fehérjéket tartalmazó standardokkal (létrákkal).

A gélelektroforézis futási ideje változó, a géltől és a futási körülményektől függően. Az mPAGE ™ bisz-tris előregyártott gélek rövidebb futási idővel (akár 15 percig) bizonyultak, mint a piacon kapható hasonló előregyártott gélek (1.ábra), anélkül, hogy elveszítené a felbontást - ezzel időt és pénzt takaríthat meg.

A versenyző T.
50 perces futási idő

mPAGE ™ előregyártott gél
35 perces futási idő

1.ábra. Fehérjék elválasztása MOPS futópuffer segítségével, összehasonlítva az mPAGE ™ Bis-Tris előregyártott gélt (4-12%) egy versenytárs előregyártott bisz-trisz géllel. Minták: festetlen fehérje marker és E.coli kivonat sorozathígítása.

Transzfer membránokra

Az elválasztás után a fehérjéket egy membránra visszük át, jellemzően Western blot (immunoblotálás) vagy más kimutatási technika céljából. A Western blot protokollokban a fehérjéket leggyakrabban elektroforetikusan továbbítják nedves (tartály) vagy félszáraz átviteli módszerrel. Az mPAGE ™ bis-tris előregyártott gélek hatékony fehérjeátvitelt biztosítanak nedves és félszáraz transzfer esetén is (2. ábra).

2. ábra. Az A431 sejtlizátum sorozatos hígításait mPAGE ™ 4-12% -os gélre töltötték, és standard módszerekkel átvitték az Immobilon®-P membránra. Az EGFR (180 kDa), az AKT1 (60 kDa) és a hiszton (17 kDa) elleni antitestekkel vizsgált blotok. Antitestek kimutatása peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel és Immobilon® Forte kemilumineszcens szubsztráttal.


A terhelésszabályozó antitestek kiválasztása

A béta-aktint és a béta-tubulint következetesen alkalmazták terhelés-kontrollként, mivel expressziójuk a legtöbb modellrendszerben viszonylag konstitutív. Néhány publikáció azonban megkérdőjelezte a β-aktin szabványos terhelésszabályozásként való használatának érvényességét (Ditmar és Ditmar, 2006 Eaton et al., 2013 Li és Shen, 2013) azon az alapon, hogy a β-aktin és a β-tubulin szintje eltérő a szövetekben, és expressziójukat befolyásolhatják a kóros állapotok. Ezek a publikációk szerzői a teljes fehérjeanalízist javasolják alternatív módszernek a kvantitatív Western -blotban, és azt javasolják, hogy a „háztartási” géntermékeket óvatosan használják a vizsgált gén expressziós mintájának tanulmányozása után. Mindazonáltal a β-aktin és a β-tubulin bizonyos előnyökkel jár, mint a terhelésszabályozás: erősen konzerváltak, magas expressziós szintet mutatnak, és a legtöbb kísérleti körülmény között stabilitást mutatnak. Fontos megjegyezni, hogy a vizsgált szövet- vagy sejttípus alapján ki kell választani egy kontrollt, és empirikus vizsgálatra lehet szükség a terhelés -ellenőrzés egységességének ellenőrzéséhez.


Western blot alternatívák - biológia

Az western blot egy analitikai technika, amelyet specifikus fehérjék kimutatására használnak a szövethomogenizátum vagy -kivonat adott mintájában. Gél-elektroforézissel választja el a natív vagy denaturált fehérjéket a polipeptid hossza vagy a fehérje 3-D szerkezete szerint.
Teljes cikk >>>

Információ a Nyugati Folt technika. Ismerje meg a nyugati foltosodás protokoll és módszer, a westernblot problémák elhárítása.
Teljes cikk >>>

Nyugati folt n.pr A HIV -expozíció megerősítő tesztje, amely azonosítja a HIV -fehérjék elleni antitesteket és. Az nyugati folt (vagy fehérje immunoblot).
Teljes cikk >>>

Részletes eljárások a Nyugati folt eltérőek. . Pierce Nyugati Folt Jelfokozó (termék # 21050). visszaállítás Nyugati Folt Lehúzás.
Teljes cikk >>>

. technikák - Példák Nyugati foltosodás alkalmazások tartalmazzák a. Bonyolultabb eljárás, Nyugati foltosodás, magában foglalja a fehérje elválasztását.
Teljes cikk >>>

Helyezzen 200 ml -t folt pufferoljon egy tálcába, és adjon hozzá egy darab szűrőpapírt. Északon, majd Nyugati folt analógia alapján nevezték el. .
Teljes cikk >>>

A Nyugati folt egy módszer a molekuláris biológiában egy bizonyos fehérje kimutatására a. A HIV -teszt "Nyugati Folt"a technika egyik változatát használja, ahol a.
Teljes cikk >>>

nyugati folt protokollok, hibaelhárítás, tudományos források és kutatás. 3. Az első papír, amely a kifejezést használja nyugati folt. Burnette WN. .
Teljes cikk >>>

Nyugati foltosodás elmondja, hogy mennyi fehérje halmozódott fel a sejtekben. . a fehérje gyorsan lebomlik, Nyugati foltosodás nem fogja jól észlelni, szükség van rá.
Teljes cikk >>>

A Pall Corporation gyárt Nyugati foltosodás membránokból készült. 1. rész - Nyugati Blotting Membránkötő kölcsönhatás, módszer.
Teljes cikk >>>

Nyugati Blotting Kemilumineszcens Luminol reagens. Fenntartott molekulatömeg -szabványok. Izotípus-specifikus másodlagos antitestek a Nyugati Blotting .
Teljes cikk >>>

Egyéb Nyugati Blotting Kit. Multiplex Folt Érzékelő készletek. ELLENŐRZÉS Címkézett Antigen ™ As Nyugati Folt Az OriGene Technologies pozitív kontrolljai.
Teljes cikk >>>

Automatizálás, új észlelési módszerek adják a régi kedvencet Nyugati foltosodás új megjelenés. . Ez azt jelenti, hogy a Nyugati folt most nem megy sehova. .
Teljes cikk >>>

Az IgG Nyugati Folt egy szendvics típusú immunvizsgálat, amelyet oly módon hajtanak végre. Az IgM ELISA kétértelmű vagy pozitív, az IgM Nyugati folt végre kell hajtani. .
Teljes cikk >>>

Nyugati Folt Eljárás. arról, hogy a nyugati folt (hivatalosabban a. Nyugati folt lehetővé teszik a kutatók számára, hogy meghatározzák egy fehérje molekulatömegét.
Teljes cikk >>>

Immunkémiai protokollok: Nyugati folt Ellenanyag. 1. lépés . Lépjen kapcsolatba velünk • Ubiquitination Antitest • Nyugati Folt Antitestek • Acetilezés.
Teljes cikk >>>


Nézd meg a videót: Western Blotting Protocol (Január 2022).